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[사용매뉴얼] Chiralpak AGP
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Operating conditions
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50*2 mm i.d.*1 100*2 mm i.d. *1 150*2 mm i.d. *1 분석용 컬럼 |
50*3 mm i.d.*1 100*3 mm i.d. 150*3 mm i.d. 분석용 컬럼 |
50*4 mm i.d.*1 100*4 mm i.d. 150*4 mm i.d. 분석용 컬럼 |
100*10 mm i.d. 150*10 mm i.d. 세미 분취용 컬럼 |
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Flow direction |
컬럼에 부탁된 라벨에 인쇄된 방향으로 연결합니다. | |||
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Typical Flow rate |
0.2 mL/min |
0.5 mL/min |
0.9 mL/min |
4.0 mL/min |
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pH range |
4.0~7.0 | |||
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권장 사용 온도 |
20~30 °C | |||
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버퍼 농도 |
최대 100mM까지, 일반적인 사용 농도 10~20mM | |||
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유기용매 함량 |
0~15% | |||
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Charged additive concentration |
최대 10mM까지 | |||
1.컬럼 내경의 작을 경우 HPLC 시스템 라인을 교체하여 최적화 하여 불감부피 발생을 줄이도록 합니다.
2.권장 온도 이상 사용시 컬럼수명이 단축될 수 있습니다.
Operation procedure
A- 이동상 시작 조건
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산성 화합물 |
중성 화합물 |
염기성 화합물 |
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일반적인 시작 조건 |
10mM Ammonium acetate buffer 1(pH 5.8)1/ 2-PrOH=95/5(v/v) | ||
1.B파트의 버퍼 제조 방법을 참조 합니다.
B- 버퍼 제조 방법
»10mM Ammonium acetate buffer (1리터)
1. 770.8mg Ammonium acetate (CH3COONH4,purity> 99%)를 측정하여 비커에 담습니다.
2. 800ml HPLC 급 증류수로 염을 잘 녹입니다.
3. 묽힌 acetic acid 혹은 ammonium hydroxide 용액으로 pH 를 조정합니다.
4. 0.22mm 멤브레인 필터를 이용하여 용액을 필터합니다.
5. HPLC 용액을 더하여 1리터가 되도록 붓습니다. 용매가 균일하게 될 수 있도록 교반한 뒤 보관합니다.
버퍼와 유기용매를 혼합할 때 부피비로 측정되며 부피플라스크 혹은 측정 피펫을 사용하여 혼합해야 합니다. 혼합 후 초음파 수조에 넣어 이동상 내에 남아 있는 기체를 탈기하여 줍니다.
Note: 전하 첨가제는 pH 측정 전에 수용액에 첨가되어야 합니다.
C- 이동상
박테리아의 경우 알코올 유기용매가 전혀 없거나 낮은 함량일 경우 빠르게 증식합니다.
분석시 새로이 이동상을 제조하여 사용할 것은 추천 드립니다.
버퍼
암모니움 아세테이트 염의 농도를 일반적으로 10~20Mm 이며 최대 100mM까지 가능합니다. Sodium, potassium phosphate, sodium acetate, formate, citrate buffer 버퍼 사용 가능합니다. LC-MS 적합성 방법에 따라 적합한 버퍼를 선택하여 사용합니다.
Organic modifier
2-PrOH, isopropyl alcohol이 가장 많이 사용됩니다. 그러나 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴의 경우도 분석법 개발시 사용될 수 있습니다. 상대적인 용출 세기는 다음과 같습니다.
2-PrOH> EtOH≥ACN>MeOH
Charged additives
양이온, 음이온 첨가제로 주로 N,N-dimethyloctyl amine(DMOA), trifluoroacetic acid (TFA),octanoic acid (OA), heptanfluorobutyric acid (HFBA) 이며 머무름, 이성질체 선택성 조절을 위해 최대 10mM까지 사용됩니다. 이러한 첨가제를 사용하게 되는 경우 컬럼 매트릭스와 높은 친화성을 가지고 있어 컬럼 세척이 어려운 경우도 종종 있습니다. 이러한 이유로 컬럼의 특성에 영향을 주게 됩니다.
주의사항: OA와 DMOA는 물에 용해 되는 양이 제한되어 있습니다. 2mM OA 혹은 5mM DMOA 사용시에만 균일하게 수용액에 용해됩니다. 농도 범위를 벗어날 경우 상 분리가 될 수 있습니다.
일단 전하 첨가제가 이동상에 첨가되어 사용하며 특정 화합물 분리 전용으로 사용되어야 합니다.
D- 샘플
컬럼에 주입되는 샘플의 양은 충분히 낮은 농도가 되어야 합니다. 권장 샘플 농도는 0.2mg/mL 혹은 그 이하의 농도에서 5~10mL 주입하시길 추천드립니다.
이동상에 샘플이 녹지 않을 경우 organic modifier의 농도를 높여 이동상이 완전히 용해 될 수 있도록 합니다. 샘플 용액은 반드시 0.5mm 멤브레인을 이용하여 침전물 및 입자가 남아 있지 않도록 필터하여 사용합니다.
주의사항:100% 유기용매 혹은 높은 함량의 유기용매에도 녹지 않는 샘플은 컬럼 내부에 침전되어 컬럼에 영향을 주게 됩니다. 완전히 용해되지 않은 샘플 및 침전물이 발생한 샘플 용액은 주입하지 않도록 합니다.
컬럼 유지 관리
컬럼의 수명은 사용 후 세척 및 보관 방법이 중요합니다.
제일 먼저,AGP 컬럼을 사용하시는 경우는 단백질성 시료가 포함된 의약품 분석에서 많이 사용하고 계십니다.
반복 주입 후 점점 분리도 및 컬럼의 성능이 저하되는 이유 중 가장 큰 이유는?
Column life 극대화를 위해 가드 카트리지 사용을 꼭 해 주세요.바이오 분석에는 꼭 주기적인 교체를 해주세요,재현성있는 분석결과 및 분석업무 효율을 높일 수 있습니다.
만약 hydrophobic compounds로 오염되었다고 판단되었을 경우, 검출기부분의 line은 연결하지 마시고 water/isopropyl alcohol=75/25 (v/v) Flow rate: 0.3ml/min (for 4mm ID column) 밤새 흘려 주어 세척합니다.
일반적으로는 10% isopropyl alcohol를 사용하시어 분석 후 버퍼염을 제거하시면 됩니다.
컬럼을 HPLC 장치에서 제거 후 보관시 water/isopropyl alcohol=85/15(v/v) 이동상이 채워져 있는것이 가장 좋습니다.
장기 보관하실 경우 water/isopropyl alcohol=85/15(v/v) 냉장고에 보관해 주시면 컬럼의 성능 저하를 방지할 수 있습니다.
주의사항
->이 사용 설명서는 다른 DAICEL 컬럼에 적용되지 않습니다.
CHIRALPAK AGP 컬럼 사용시 가드 컬럼 사용을 강력히 추천드립니다. 이는 침전물 입자 혹은 정지상과에 흡착될 수 있는 불순물로부터 분석용 컬럼을 보호하는 방법입니다. 바이오 분석의 경우 주기적으로 가드 컬럼을 교체하여 사용해 주십시오.
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